Bakterienes livsstil i en biofilm

En bakteriell biofilm består av bakterier festet til et underlag i en omgivende matriks. Matriksen som holder bakteriene sammen, er en blanding av polysakkarider, proteiner og DNA som stammer fra bakteriene (2). Bakterier i biofilm danner tredimensjonale strukturerte samfunn med væskekanaler for blant annet transport av næringssubstrater, avfallsprodukter og ulike signalmolekyler (3).

Bakterier i biofilm er langt mindre sensitive overfor antimikrobielle stoffer og vertens immunforsvar enn når de lever fritt i flytende medium (4). Konsentrasjonen av et stoff som dreper fritt flytende bakterier må økes, gjerne fra ti til tusen ganger for å ha tilsvarende effekt når bakteriene vokser i biofilm (4). Dette er nettopp hva van Leeuwenhoek i sin tid observerte med vineddiken han testet. Denne tilsynelatende resistensen kan forklare hvorfor mange stoffer benyttet til oral profylakse har dårligere effekt klinisk enn forventet ut i fra laboratorietester.

En forklaring på denne tilsynelatende resistensen har vært at strukturen i en biofilm hindrer diffusjon av aktive molekyler inn i dybden av biofilmen, eller at molekylene inaktiveres i overflaten av biofilmen. En annen forklaring på den tilsynelatende resistensen kan være bakterienes varierende veksthastighet i biofilmen. Det er slik at bakterienes sensitivitet er avhengig av deres veksthastighet. En bakteriekultur som vokser fort, vil være mest sensitiv overfor et hemmende stoff. Bakteriene vokser langsommere i biofilm enn i flytende medium. Derved blir bakteriene mindre sensitive.

I en biofilm dannes ulike mikromiljøer på grunn av gradienter av for eksempel næring, avfallsprodukter, pH og oksygen. Dette registrerer bakteriene og tilpasser seg de varierende forhold ved å skru av og på gener etter sine egne behov. En slik tilpasning krever regulering av et stort antall gener. Nyere forskning har vist at bakteriene på denne måten endrer egenskaper når de befinner seg i en biofilm.

Når for eksempel Streptococcus mutans vokser i biofilm, blir ca. 20 % av dens gener enten oppregulert eller nedregulert i forhold til når den lever i flytende medium (5). Enzymene som S. mutans bruker til å lage polysakkarider uttrykkes også i forskjellig grad avhengig av om biofilmen er tykk og moden eller tynn og umoden (6). Andre eksempler på endret genaktivitet i biofilm er enzymet urease i Streptococcus salivarius og sekretering av en rekke proteiner i Actinobacillus actinomycetemcomitans (7).

Biofilmdannelse i Pseudomonas aeruginosa, som forårsaker alvorlig lungebetennelse hos pasienter med cystisk fibrose, er mye studert. I biofilm sammenlignet med frittflytende bakterier og i ulike stadier av biofilmdannelsen har man funnet mellom 40 og 50 % forskjell i uttrykte gener hos denne bakterien (8).

Biofilmdannelse er en trinnvis prosess som starter med adhesjon av frittflytende bakterier til en proteindekket overflate, etterfulgt av kolonisering, koadhesjon, modning og løsning av enkelte bakterier (Fig. 1). Det er gode holdepunkter for at uttrykk av gener som er involvert i de ulike prosessene er koordinerte og velregulerte (8 – 10). Dette skjer via forskjellige signalsystemer som tillater bakteriene å kommunisere med hverandre. I bakteriene setter kommunikasjonen i gang kaskader av reaksjoner. Resultatet kan være aktivering eller hemning av transkripsjon av ulike gener.

Bakteriene kan reagere på eksterne stimuli i miljøet. I dette tilfellet kan de bruke signalmolekyler som vi ennå ikke kjenner. I andre signalsystemer er molekylene bedre kjent. Bakterietetthet er en type stimulus som kan sette i gang signalsystemer. Slike bakterie-tetthetsavhengige signalsystemer kalles «quorum sensing»-systemer. Ordet «quorum» betyr «det minste antall medlemmer av en forsamling som må være tilstede for at forsamlingen skal være beslutningsdyktig».

Bakteriene benytter ulike molekyler som quorum-signaler. Konsentrasjonen av signalmolekyl vil være en funksjon av bakterietettheten. Ikke før konsentrasjonen av signalmolekyler har nådd en viss terskelverdi, quorum, vil bakterien være i stand til å registrere og respondere på signalet. Når antall bakterier når det kritiske nivå, kan de ved hjelp av quorum-signaler koordinere sine genuttrykk (Fig. 2). For bakteriene betyr dette at de kan skru av eller på viktige gener på en koordinert måte. De kan med andre ord «trekke i flokk».

Vi finner mange quorum-signalsystemer i både grampositive og gramnegative bakterier. Bakteriene benytter ulike signalmolekyler som quorum-signaler. Grampositive bakterier benytter oligopeptider som signalmolekyler, mens gramnegative bakterier benytter homoserin-laktoner. Mange quorum-molekyler er svært spesifikke. Dette innebærer at de kun kan benyttes til kommunikasjon mellom bakterier av samme spesies. Nylig avdekket man imidlertid et annet kommunikasjonssystem, autoinduser-2-systemet (AI-2). I motsetning til de fleste andre quorum-systemer som benyttes av bakteriene til intra-spesies-kommunikasjon, kan bakteriene benytte AI-2-systemet som et mer generelt, inter-spesies, kommunikasjonssystem. Enkelt kan man si at ved hjelp av det tidligere beskrevne quorum-systemet kan bakterien kommunisere med og kontrollere sine likemenn, mens AI-2 i tillegg kan benyttes til å kommunisere med andre (11).

AI-2 ble først beskrevet å stimulere bioluminiscens i marine bakterier slik som Vibrio harveyi (12). I Fig. 3 ser vi hvordan en bakteriekultur av V. harveyi skrur på genene for luminiscens og lyser med et blålig lys når tettheten av bakteriekulturen når et visst nivå. Senere studier har bekreftet at en rekke både grampositive og gramnegative bakterier har gener for å produsere AI-2-signalmolekyler (13, 14). Strukturen til AI-2 fra V. harveyi ligner ikke noen andre kjente signalmolekyler. For de fleste andre bakterier kjenner man ikke molekylstrukturen for AI-2. Man vet imidlertid at produksjonen av AI-2 avhenger av et enzym som kodes for av genet LuxS. DNA-sekvensen for dette genet ser nokså lik ut i mange bakterier (15).

Kommunikasjon i plakkbiofilm

Det er rimelig å anta at det foregår livlig kommunikasjon mellom bakteriene i plakkbiofilm. I laboratoriet har man påvist evnen til kommunikasjon hos ulike orale bakterier (Tabell 1). Kommunikasjon via signalsystemer ble først vist i Streptococcus gordonii (16). Ved å inaktivere et gen som regulerer evnen til naturlig transformasjon i S. gordonii, fant man at de også mistet evnen til å danne biofilm. Naturlig transformasjon innebærer en tilstand der bakteriene er i stand til å ta opp DNA fra omgivelsene, inkorporere det nye DNA i sitt eget genom, og derved få endrete egenskaper. Man tenker seg at streptokokkene ved slik naturlig transformasjon lett kan tilpasse seg skiftende miljøforhold ved å tilegne seg egenskaper fra andre bakterier. Naturlig transformasjon i S. gordonii reguleres av et quorum-signalsystem. Signalmolekylet i dette systemet er et peptid, det såkalte kompetansestimulerende peptid (CSP) (17). Ved å inaktivere gener knyttet til kompetanseutvikling, for eksempel genet som koder for CSP i S. mutans, fant man at bakteriens evne til å lage biofilm ble sterkt redusert (18, 19). I Fig. 4 ser vi hvordan vi ved å tilsette CSP stimulerer bakteriene til å danne mer biofilm. I tillegg til å indusere naturlig transformasjon regulerer CSP også bakterienes evne til å tåle stress (20). For eksempel er dette systemet involvert i evnen S. mutans har til å tilpasse seg et surt miljø (21).

Signaloverføring via AI-2 systemet og genet for LuxS er påvist i flere orale bakterier, for eksempel i Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, A. actinomycetemcomitans, S. mutans (22, 23) og S. gordonii (24 – 27) (Tabell 1).

Betydningen av AI-2-signalering for biofilmdannelse i S. mutans (22, 23) og S. gordonii (24) er ikke avklart. Inaktivering av LuxS-genet synes imidlertid å påvirke S. mutans i biofilmdannelsen når den har tilgang til sukker (23). I S. gordoni, fører tilsvarende inaktivering til endret uttrykk av enzymer knyttet til karbohydrat-metabolismen (24). P. gingivalis endrer uttrykk av virulensfaktorer slik som haemagglutinin og protease-aktivitet når LuxS-genet inaktiveres (25, 26). I A. actinomycetemcomitans stimuleres leukotoksin-produksjonen av AI-2 (26). AI-2 er også involvert i bakteriens tilpasning til et miljø som har begrenset tilgang på jern (26, 27).

Siden AI-2 systemet benyttes for inter-spesies-kommunikasjon, er studier av biofilmer med flere typer bakterier særlig viktig. S. gordonii og P. gingivalis danner normalt biofilm sammen. Interessant nok ble det nylig vist at inaktivering av LuxS-genet i P. gingivalis og i S. gordonii førte til at biofilmdannelsen ble sterkt redusert (24).

Profylakse

Den senere tids utvikling og spredning av multiresistente bakteriestammer og hyppige forekomst av behandlingsresistente biofilminfeksjoner gjør at man søker andre måter å bekjempe bakterielle infeksjoner på. Tiden er inne for å gå fra bruk av antibakterielle til antipatogene stoffer. Det vil si, istedenfor å ta livet av bakteriene bør man søke å gjøre dem mindre farlige ved å regulere og begrense deres uttrykk av virulensfaktorer.

En mulig vei i fremtiden vil kunne være å interferere med bakterienes kommunikasjonssystemer. Ved hjelp av tilgjengelige gensekvensdata fra bakterielle genomer og fra det humane genom kan man identifisere aktuelle genmål som er unike for bakterier.

For terapeutiske formål vil essensielle gener for bakterienes liv representere aktuelle mål. For profylaktiske formål er det rimelig å interferere med bakterienes muligheter for å forårsake sykdom uten at balansen i normalfloraen forstyrres.

I munnhulen kan man tenke seg å benytte slike mekanismer for eksempel for å etablere en økologisk balanse som opprettholder oral helse.

Vi antar at en moden plakk-biofilm er resultatet av en serie velregulerte prosesser, hvor hver av dem kan representere et potensielt mål for biofilm-kontroll. I det følgende vil vi diskutere hvordan vi tenker at interferens med signaloverføring kan utnyttes som profylaktisk metode.

Interferens med signaloverføring

Den australske rødalgen Delisea pulchra unngår å bli kolonisert av bakterier ved at den produserer såkalte furanoner som sekundære metabolitter. Furanon har en tilsvarende struktur som quorum-signalmolekylene homoserinlaktoner. Homoserinlaktoner benyttes som quorum-signal av gramnegative bakterier. Furanoner kan syntetiseres og er vist å kunne hemme biofilmdannelse i P. aeruginosa (28). Man har også funnet andre molekyler i naturen som kan forstyrre homoserin-laktonmediert signaloverføring, for eksempel molekyler produsert av bacillus og variovorax-spesies (29, 30).

Ved å fjerne acylgruppen på homoserinlaktoner vil signaloverføringen forstyrres. Enzymet acylase I fra svin ble nylig vist å være i stand til å deacylere homoserinlaktoner fra gramnegative bakterier (31). I marine bakterier førte dette til redusert biofilmdannelse.

En annen mulighet til å interferere med signaloverføring er å benytte syntetiske signalmolekylanaloger. Det er rapportert om både agonister og antagonister (32, 33).

Staphylococcus aureus benytter tiolakton oligopeptider som signalmolekyler. Disse kan virke både som aktivatorer og inhibitorer av quorum-signaler. Naturlig forekommende signalmolekyler med små endringer kan redusere virulensen i S. aureus (34).

I odontologisk sammenheng er det interessant at det bredspektrede triclosan som benyttes i blant annet tannpastaer, hemmer syntese av forløperen for homoserinlaktoner (35). Homoserinlakton-signaler er i midlertid ikke påvist i orale bakterier (14, 25).

De kjente quorum-signalsystemene i orale bakterier inkluderer AI-2-systemet og det peptidinduserte signalsystemet (CSP). AI-2-systemet anses som et universelt quorum-system som benyttes av både grampositive og gramnegative bakterier. Derfor kan AI-2 representere et interessant mål for profylakse. Det er vist at AI-2 påvirker bindingen av P. gingivalis til S. gordonii i biofilm (24). Vi mangler fortsatt kunnskap om AI-2s rolle i plakkbiofilmer. Slik kunnskap er nødvendig for å vurdere mulighetene for profylaktisk intervensjon via dette systemet.

Å interferere med CSP-signalsystemet kan være en annen måte å bekjempe biofilmrelaterte sykdommer på. S. gordonii og S. mutans’ evne til å danne biofilm kunne tenkes redusert ved å interferere med dette systemet. Vi kjenner foreløpig ikke til om tidlige kolonisatorer som Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, og Streptococcus mitis, som alle produserer CSP og bruker signalet for å indusere naturlig kompetanse, også benytter signalet i biofilmdannelse. Det vil være interessant å finne ut om tilsetting av syntetisk CSP kan indusere til biofilmdannelse når det nødvendige quorum ikke er til stede. I tilfelle kunne CSP benyttes til å etablere en beskyttende biofilm som kunne forhindre kolonisering av mer virulente stammer. Vi vet at quorum-systemer og andre signalsystemer avhenger av miljøfaktorer. Det er derfor vesentlig å finne ut om de opererer, også under relevante kliniske betingelser.

Perspektiv

Dersom forebyggelse av oral sykdom skal basere seg på angrep på, eller forebyggelse av biofilmdannelse, er det vesentlig å vite om bakteriene har utviklet spesifikke mekanismer for å leve et liv i biofilm. I så fall vil mekanismene som inngår i biofilmdannelsen være konserverte og egnede mål for intervensjon. Stadiene i biofilmdannelse synes å følge tilnærmet samme mønster i ulike bakterier, men biofilm-arkitekturen og de molekylære mekanismer som er involvert, varierer. Mekanismene for biofilmdannelse i P. aeruginosa er vel karakterisert og tjener som modell for hypoteser om mekanismene i andre bakterier. Muligheten for å interferere med quorum-systemer i orale bakterier representerer en interessant mulighet for å forebygge oral sykdom i fremtiden. Imidlertid mangler vi fortsatt informasjon om de molekylære mekanismene og signalveiene som er involvert i dannelse av plakkbiofilm. Her ligger en viktig forskningsmessig utfordring.