HPV:s genom

HPV är ett litet virus som har ett cirkulärt genom som består av dubbelsträngat DNA med en storlek på cirka 8 000 baspar. Genomet kan delas in i så kallade tidiga (early, E) och sena (late, L) läsramar (open reading frames, ORF) efter hur de bidrar till infektioner som leder till virusreplikation (Fig. 1). Läsramarna som kodar för proteiner finns endast i den ena DNA-strängen (2,11). De tidiga generna (E1–E7) uttrycks strax efter att infektionen skett, innan DNA: t börjar replikera (12,13). De proteiner som produceras reglerar replikationen och uttrycket av virusets DNA. Proteiner som produceras av virusens tidiga genregioner (i första hand E6 och E7) bidrar också till att göra värdcellen odödlig och omvandlar den till en malign cell (1,2,14). De sena generna (L1 och L2) ger däremot upphov till strukturella virusproteiner och aktiveras i slutskedet av viruscykeln (15). Den region i genomet som blir avläst motsvarar inte direkt ett visst protein. Ett proteins struktur kan nämligen bestämmas av flera regioner som fogas ihop. I Tabel 1 ses läsramarna för HPV och lokalisationen samt funktionen för de proteiner som läsramarna producerar.

HPV-genomet innehåller förutom läsramar också en lång kontrollregion, en region som inte producerar protein (long control region, LCR) (Fig. 1). Kontrollregionen är cirka 1 000 baspar stor. Många av värdcellens proteiner fäster vid denna region som viruset utnyttjar för att styra replikation av sitt genom och för cellens maligna omvandling (2,12,16). Även många av virusets egna proteiner (bland annat E2) fäster vid den här kontrollregionen och reglerar därmed bland annat uttrycket av cancergenerna E6 och E7. Virusets genom kan integreras med värdcellen i kromosomer. När detta sker öppnar sig den dubbelsträngade HPV-cirkeln (vanligen inom läsregionen E2) och viruset integreras slumpmässigt med värdcellens genom (Fig. 1, nedre delen). Integreringen leder till att E2-proteinets reglerande funktion på uttrycket av cancergenerna E6 och E7 hindras och möjliggör ett överuttryck av cancergenerna (16,17).

Klassifikation

Papillomvirusen är uråldriga och genomet har förändrats mycket lite under de senaste årmiljonerna. Virusen är artspecifika, det vill säga människans papillomvirus kan endast infektera människan och papillomvirus hos djur (som förekommer bland annat hos katt, nöt, hund och ren) kan endast infektera sin specifika art.

Ursprungligen klassificerades papillom- och polyomvirusen under samma grupp (polyomavirus) eftersom de föreföll lika när man studerade dem med elektronmikroskopi. (De var ikosahedrala DNA-virus med två strängar och saknade hölje.) Det framkom dock på 1980-talet att virustyperna trots allt har rätt lite gemensamt både vad gäller genomet och genfunktionerna.

För närvarande känner vi till 106 olika typer av papillomvirus hos människan men man uppskattar att det totala antalet HPV överskrider 200 (18). HPV-virusen kan grupperas efter den målvävnad de infekterar: slemhinnor (till exempel HPV 6, 11, 42) eller hudvävnad (HPV 2,4,7). Man kan också dela in HPV efter cancerrisk, det vill säga i lågrisktyper (HPV 6,11,42) och högrisktyper (HPV 16,18,31,33,35). Numreringen följer kronologin för när de upptäckts medan typningen baserar sig på bassekvensen i generna L1, E6 och E7. Om genomets bassekvens avviker med mer än 10 procent från en tidigare identifierad virustyp är det fråga om en ny typ. Om differensen är mindre än 10 – 2 procent är det en subtyp, och om sekvensdifferensen är mindre än 2 procent handlar det om en HPV-variant.

År 2004 ändrades klassifikationen av HPV-virusen i och med att de äntligen godkändes som en separat grupp (Papillomviridae) i den internationella virusklassifikationen (International Council of Taxonomy of Viruses, ICTV) (18). Den nya klassifikationen bygger på ett släktträd som för papillomvirusgenomet. Släktträdet består av olika släkten som i sin tur består av arter. Papillomvirusens släktträd innehåller 16 släkten som anges med grekiska bokstäver. De kliniskt mest betydelsefulla HPV-typerna hänförs till släktet a-papillomvirus som i sin tur delas in i arter. Bland arterna finns även papillomvirus som förekommer hos apa och schimpans (18). Huvuddelen av alla HPV-typer som associeras med skivepitelcellscancer hör antingen till art nummer 9 (HPV-typer 16, 31, 33, 35, 52, 58, 67) eller 7 (HPV 18, 39, 45, 59, 68, 70). HPV-typerna 2, 27 och 57 (som faller under art 4) orsakar vårtor och förekommer i munhålan. Under art 10 räknas HPV typ 6 och 11 som orsakar papillomen samt HPV 13 som orsakar fokal epitelial hyperplasi (FEH). FEH orsakas också av HPV 32 som tillhör art 1. Människans papillomvirus typ 13 anses ursprungligen ha varit ett schimpanspapillomvirus som genomgått mutationer för cirka fem miljoner år sedan.

Diagnostik

HPV går inte att odla in vitro och den serologiska diagnostiken är ännu i sin linda. Därför baserar sig HPV-diagnostiken på att visa förekomsten av virusets DNA eller RNA med olika molekylärbiologiska metoder. De genetiska variationerna mellan olika HPV-typer är minst på L1-området. Därför används detta område av virusgenomet som målsekvens vid DNA-diagnostik som baserar sig på genamplifiering (1). Det finns ett flertal kommersiella HPV-test, bland annat Hybrid capture 2 (Digene, Gaithersburg, Maryland, USA), Amplicor (Roche, Basel, Schweiz), PreTect HPV-Proofer (NorChip, Klokkarstua, Norge) och InnoLiPA (Innogenetics, Gent, Belgien). HPV-proteinet L1 kan också påvisas ur vävnadsprover med histoimmunologisk teknik men sådana prov visar endast positivt resultat om viruset produceras aktivt. Vid denna testning används i allmänhet en antikropp som tagits fram mot papillomvirus hos nöt och som även reagerar med många HPV-typer hos människa.

HPV-proteiner

Tabell 1 visar de proteiner som produceras av HPV-virusets läsramar, deras uttryck i cellen samt proteinernas centrala funktioner. E1 öppnar DNA-strängen och är nödvändig för replikationen av genomet samt för transkriptionsregleringen. E2 är en transkriptionsfaktor som också reglerar transkriptionen av E6 och E7. E4 binder vid cytoplasmats cellskelett. Nyligen har man visat att den även påverkar generna E6, E7 och L2. E5, E6 och E7 är transformerade proteiner vars funktion kommer att beskrivas detaljerat längre fram i artikeln.

HPV-högrisktyperna 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 56, 59, 66, 68, 73 och 82 ger cellen odödlighet och vissa transformeringsegenskaper. Detta beror främst på att virusets E6- och E7-gener producerar ämnen som kan binda ett stort antal av de proteiner som värdcellen producerat (Tabell 2 och 3) (19 – 59). Dessa proteiners funktion är bland annat reparation av DNA och reglering av celldelningen. De viktigaste målen för E6- och E7-proteinerna är «väktaren av människans genom» p53 samt retinoblastoma proteinet pBR – två centrala reglerare av celldelningscykeln. Särskilt HPV (med hög risk för att bli elakartad) har förmåga att tvinga cellen till delning eftersom viruset behöver proteiner som syntetiseras av värdcellen då den delar sig för sin egen replikation. Dessutom fördröjer HPV celldifferentieringen, hämmar reparationsmekanismerna för DNA, förhindrar den programmerade celldöden (apoptos) och gör den infekterade cellen osynlig för kroppens försvarsmekanismer. Dessa processer gör så småningom cellen odödlig. I slutet av detta invecklade förlopp kan cellen utvecklas till en cancercell eftersom HPV gör det möjligt för mutationer att lagras i värdcellens genom (16, 60 – 62). HPV-infektionen leder till förändringar på cell- och molekylärnivå som i dag är förhållandevis väl utredda.

Viruscykeln

Det sannolika målet för papillomvirusinfektionerna är skivepitelvävnadens basalceller (11, 64, 65). HPV utnyttjar receptorer på målcellens yta för att infektera cellen. Receptorerna på HPV är ännu inte helt kända men heparansufat och a6b4-integrin är goda receptorkandidater (65, 66). Efter infektionen binder värdcellens proteiner till LCR-regionen och inleder transkriptionen av E1- och E2-generna i HPV-viruset.

E6- och E7-generna stör cellens normala delning på många olika sätt. E6 binder till proteinet som «genomväktargenen» p53 framkallar, medan E7 bland annat binder till retinoblastomproteinet (pRb). Därefter läses generna E1 och E2 av. E2 hindrar avläsningen av E6 och E7 och gör det möjligt för E1 att fästa vid den plats inom regleringsområdet som inleder replikeringen av virusets genom. I epitelets mellanskikt uttrycks nu både E4 och E5 och inom epitelets ytskikt uttrycks de sena generna L1 och L2 och gör det möjligt för mogna viruspartiklar att produceras (11, 67, 68) (Fig. 2).

HPV stör cellcykeln

Ett flertal nya rön har visat att de proteiner som syntetiserats genom uttryck av de tidiga HPV-generna kan leda till att kontrollpunkterna i cellcykeln ignoreras genom att de binder till cyklin och cyklinassocierade kinaskomplex eller andra faktorer som reglerar cellcykeln. De bäst kända av dessa proteiner är de som uppkommer genom uttryck av cancergenerna E6 och E7 av HPV-högrisktyper som binder till många proteiner som är centrala för cellcykeln (19 – 59) (Tabell 2 och 3). De viktigaste proteinerna av detta slag är p53 som E6 binder till samt retinoblastomproteinet som E7 binder till (33 – 37). HPV-proteinet E5 stör också cellcykeln på många olika sätt och verkar som transformerande protein (13, 16).

På grund av HPV-infektionen kan cellen bli odödlig och omvandlas till en cancercell. HPV-genomet kan enbart replikeras när värdcellen delar sig. Därför tvingar de HPV-relaterade proteinerna värdcellen till celldelning. Celldifferentieringen fördröjs och epitelvävnadens ytskikt är kraftigt differentierat för att produktionen av viruspartiklar ska kunna sättas igång. När cellen delar sig utsätts genomet för mutationer som under normala förhållanden korrigeras av cellens genomväktare, p53. Men när cellen infekterats av HPV kan p53 inte längre identifiera de fel som uppstår. Cellen delar sig och mutationerna anhopas i genomet. Som bieffekt bildas en odödlig cell som småningom blir elakartad.

För att cellcykeln ska kunna gå vidare mot mitos sker olika kontroller inom cellen: 1) Har cellen rätt storlek inför mitosen, 2) är DNA oskadat samt 3) är miljön i cellen gynnsam? Vid GI-stadiet spjälkas cykliner och det bildas hämmande proteiner som i sin tur hämmar de cyklinberoende kinaserna (cdk 1 – 9). De cyklinberoende kinaserna förs in i sitt målprotein genom att de kopplar på en fosfatgrupp till målproteinets serin- eller treoninaminosyra. Initialt under HPV-infektionen fungerar G2 (en av cellcykelns övriga viktiga kontrollpunkter) men till slut leder mutationerna i värdcellens genom (som delvis beror på inverkan av E6) till en funktionsstörning i cellcykelns G2-kontrollpunkt. HPV 16 kan påverka G2/M-kontrollpunkten på många olika sätt, exempelvis genom att öka uttrycket av cdk2, cyklin A och cyklin B (2, 16, 58).

Cellcykeln och HPV E7

Cykliner är proteiner som uttrycks i cellen vid givna faser i cellcykeln. Dessa proteiner reglerar cellcykeln genom att binda till de cyklinberoende kinaserna och aktivera dem. Fig. 3 visar de faser i cellcykeln då de enskilda cellcyklinerna uttrycks samt hur E7-proteinet från högrisk-HPV stör så väl funktionen av cyklinerna, de cyklinberoende kinaserna som cdk-hämmarna (58). E7-proteinet gör det lättare att passera den sena kontrollpunkten G2/M i cellcykeln och leder till att replikationen av kromosomerna blir ofullständig. Det uppstår anaeuploida celler, celler där kromosomantalet avviker från det normala (Tabell 3) (35 – 59).

Cellcykeln och E6

E6 från högriskpapillomviruset tar sig förbi G1 i ett tidigt skede och bryter ner p53 sedan p53 kopplats till E6 (23,33). Nedbrytningen beror på att proteinet E6AP binds till E6. Att E6AP binds till E6 är en nödvändig förutsättning för E6 ska kunna binda till p53. När p53 bryts ner hämmas funktionen av den cyklinberoende kinashämmaren p21 vilket i sin tur gör det lättare för viruset att passera kontrollen vid G1 (Fig. 4).

Kliniska fynd i munnen associerade till HPV-infektioner

HPV-infektioner ger upphov till godartade tumörer i munnen: vårtor, papillom/kondylom och fokal epitelial hyperplasi. Man har också påträffat papillomvirus i orala lichenläsioner, leukoplakier och erytroplakier. Virusets roll vid uppkomsten av dessa tillstånd är dock fortfarande oklar (1,69). Tidigare ansåg man att HPV smittar via oralt könsumgänge. Våra tidiga undersökningar visar dock att barn kan vara infekterade i munnen eller könsorganen med HPV. Barnen har uppenbarligen infekterats av modern redan under förlossningen. Hos vuxna medför kronisk oral HPV-infektion att partnerns risk för att få oral HPV-infektion ökar tiofaldigt (70 – 72). Det naturliga förloppet hos de orala infektionerna påminner om det naturliga förloppet hos HPV-infektioner i könsorganen (72). Cirka 10 procent av populationen har HPV-DNA i vad som ser ut att vara en frisk munslemhinna. Tandköttsfickorna och tonsillerna kan vara dolda infektionshärdar för HPV-infektioner i munhålan (73,74).

Orala vårtor uppstår oftast som en följd av infektion med HPV-typerna 2, 4 och 57. Den kliniska bilden är både varierande och ospecifik. Baserat på kliniska fynd går det dock inte att avgöra om det gäller en vårta av den typ som uppstår på huden eller slemhinnepapillom respektive slemhinnekondylom. Papillom är godartade, blomkålsformade epiteliala tumörer som oftast orsakas av HPV 6 eller 11 (1,69). Hos barn utgör papillomen 7 – 8 procent av samtliga godartade tumörer jämfört med 0,5 – 3,0 procent i den vuxna populationen. Tidigare ansågs kondylom och papillom vara två olika tillstånd både etiologiskt och histologiskt. I takt med att DNA-tekniken utvecklats har man kunnat visa att såväl kondylomen som papillomen snarast är relaterade till infektion med HPV 6 och/eller HPV 11. Det är dock tänkbart att en del av papillomen kan uppstå på grund av mekanisk irritation (1, 69).

I litteraturen beskrevs fokala epiteliala tumörer (FEH) första gången redan på 1800-talet. Som namnet antyder består FEH av små, ljusa upphöjningar i munslemhinnan. Förändringarna kan förekomma isolerat eller, vilket är vanligare, i form av multiforma förändringar som ses i underläppen och på andra håll i munhålans slemhinna (1,69). Det finns också karaktäristiska FEH-celler som troligen är celler i apoptos. FEH är ett godartat tillstånd som orsakas av HPV typ 13 och 32 som endast förekommer i munnen. Det har dock nyligen beskrivits två fall där FEH övergått i cancer hos två patienter som behandlats med bromsmedicin mot HIV (HART). FEH är ärftligt: HLA-DRB10404-allelen associeras med en ökad risk för kliniska infektioner som beror på HPV 13 (75).

Muncancer och HPV

År 2002 var den globala incidensen av oral cancer 274 850. I utvecklingsländerna låg oral cancer på sjunde plats bland de vanligaste maligna sjukdomarna hos män och på åttonde plats bland kvinnor (76) jämfört med i-länderna 11 för män och 15 för kvinnor. År 2002 avled 127 783 människor i den här formen av cancer (76). De mest betydelsefulla riskfaktorerna för muncancer är rökning och alkoholkonsumtion. Risken är dosrelaterad: Ökad konsumtion av såväl tobak som alkohol ökar risken flerfaldigt. Riskfaktorerna förklarar 80 – 85 procent av alla fall av muncancer.

En ny metaanalys (77) visar att sannolikheten för att identifiera HPV-DNA i munslemhinnan växer i takt med graden av dysplasi. I 94 undersökningar analyserades 4 680 prover och forskarna uppgav att sannolikheten för att upptäcka HPV i frisk munslemhinna var 10 procent (95 % CI = 6,1 – 14,6), i leukoplakiförändringar 22 procent (95 % CI = 15,7 – 29,9), verruköst carcinom 29,5 procent (95 % CI = 23,0 – 36,8) och skivepitelcellscancer 46,5 procent (95 % CI = 37,5 – 55,5). Sannolikheten för att finna en högriskvariant av HPV var 2,8 gånger högre än att finna en lågriskvariant (0,24; 95 % CI=0,16 – 0,33 respektive 0,09; 95 % CI = 0,06 – 0,13).

I litteraturen har man fram till slutet av år 2004 beskrivit 6 500 fall av oral cancer där man använt HPV-testning. Av dessa var 20 procent positiva (5,6). Den vanligaste HPV-typen var typ 16 (cirka 80 % av fallen). Näst vanligast var typ 18. I några fall av muncancer har också lågriskvarianterna 6 och 11 påträffats. På senare tid har ett flertal så kallade case-controlstudier som fastställer HPV-infektionen som en självständig riskfaktor för oral cancer publicerats. Av dessa framgår det att HPV-infektion ökar risken för cancer 5,4 gånger (78 – 80). Forskningen visar att särskilt cancer i tunga och tonsiller har samband med HPV-infektion. Patienter med HPV-positiv oral cancer tycks ha en bättre prognos än patienter med HPV-negativ cancer. HPV-infektioner förekommer oftare hos icke-rökare än hos rökande muncancerpatienter. Enligt en nordisk undersökning kunde HPV L1-antikroppar påvisas två gånger oftare hos personer som fick tungcancer efter 10 – 20 år jämfört med kontrollpersoner (81). Även detta fynd talar för att exponering för HPV föregår sjukdomsutbrott.

Virusrelaterade särdrag och muncancer

Inte bara HPV-typen är relaterad till uppkomsten av cancerceller. Andra viktiga virusrelaterade faktorer är; 1) det totala antalet virus i den infekterade cellen, 2) virusets integrering i värdcellens genom samt 3) hur stort uttrycket av E6- och E7-cancergener är. Integreringen av viruset i värdcellens genom kan bland annat undersökas med hjälp av tvådimensionell så kallad Southern blot hybridiseringsteknik eller PCR där det genområde som förstärks utgörs av HP-virusets E2. Denna gen bryts nämligen upp i mindre beståndsdelar vid integreringsprocessen och bortfaller delvis vilket ger ett negativt resultat vid PCR. Den nyaste metoden kallas realtids-PCR och betyder också att man kan bestämma mängden av den gen som förstärks eller dess mRNA. Metoden har använts för att identifiera integrerat HPV 16-material i prover (82). Koskinen et al. (83) kunde med hjälp av realtids-PCR identifiera HPV i 16 av 61 biopsier från cancer i mun, huvud och hals. Virusgenom fanns integrerat i 48 procent av fallen och episomalt i 35 procent. I 17 procent av muncancerbiopsierna fann man bägge formerna.

Antalet replikerade viruskopior i muncancervävnaden är ännu inte helt känt. Studier harvisat att endast en del av cancercellerna är positiva för virus och att virusmängden dessutom är låg i dessa celler. Det skulle kunna betyda att endast en del av HPV replikeras i cancercellerna alternativt att cancern inte är av klonalt ursprung. I sina studier fann Koskinen et al. (83) endast 1 – 97 viruskopior per 10 000 orala cancerceller. De senaste åren har man inte bara studerat förekomsten av virusgenom i cancerceller utan också uttrycket av dess cancergener för att om möjligt kunna belysa den virala aktiviteten (84 – 86). I cirka hälften av fallen av HPV-DNA-positiva muncancerformer var mRNA uttryckt. Detta uttryck var associerat med normalt p53 i tumören (wild-type) (86) med nedsatt pRB och ett överuttryck av p16 i tumörerna. Uttrycket av HPV 16 E6/E7 har också associerats med en specifik morfologi i cancervävnaden (87) och en nedsatt allelförlust hos 13 av 15 markörer för kromosomerna 3p, 9p och 17p (86).

Både terapeutiska och profylaktiska vacciner har utvecklats mot HPV. En del av dessa vacciner provas för närvarande i kliniska studier. Om de profylaktiska vaccinerna visar sig vara effektiva skulle upp till 25 procent av de olika cancerformerna i huvud- och halsområdet kunna förebyggas (88).